نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم زیستی، واحد ورامین- پیشوا، دانشگاه آزاد اسلامی ورامین، ورامین، ایران

2 گروه تحقیق و توسعه ماهیران، شرکت پروتئین گستر سینا، تهران، ایران

3 گروه بیولوژی دریا، دانشکده منابع طبیعی، واحد بندرعباس، دانشگاه آزاد اسلامی بندرعباس، بندرعباس، ایران

چکیده

سابقه و هدف:
بررسی تنوع ژنتیکی ابزار موثری در حفظ ژنتیکی گونه­ های پراهمیت، با ارزش و هم­چنین گونه ­های کمیاب در معرض خطر انقراض می­ باشد. با توجه به اینکه مطالعات، در ارتباط با گونه­ های خرچنگ­ های آب شیرین در ایران بسیار اندک است و از نظر حفاظتی توجه چندانی به آن­ها صورت نگرفته است. این مطالعه به بررسی تنوع ژنتیکی خرچنگ حقیقی Potamon elbursi در رودخانه­ های شرق استان تهران می پردازد. 
مواد و روش ­ها:
 برای بررسی تنوع درون این گونه 10 ایستگاه نمونه‌برداری در بخش­ های مختلف رودخانه­ های جاجرود، حبله ­رود و لار انتخاب شد و تعداد 10 نمونه از هر ایستگاه با تور دستی مورد صید قرار گرفتند، سپس نمونه­ ها در الکل اتانول 96 درصد تثبیت و برای انجام مرحله­ های بعدی به آزمایشگاه منتقل شدند. نمونه­ ها در ابتدا برای مطالعات ریخت­ شناسی توسط کلیدهای شناسایی مورد مطالعه قرار گرفتند و سپس برای بررسی ­های مولکولی از ژن قطعه ژنی زیر واحد یک سیتوکروم اکسیداز میتوکندری (COI) و نشانگر ریزماهواره استفاده شد. برای استخراج ژنوم از کیت استخراج DNA سیناژن استفاده گردید و کیفیت و کمیت DNA توسط بیوفتومتر و ژل آگاروز 1% درصد مورد بررسی قرار گرفت. برای شناسایی مولکولی،  ژنCOI  تکثیر و توالی یابی شد. سپس برای بررسی پنج جایگاه ژنی (hxx3،Gagt4،Ga1،Ga2،hxx2) از آغازگرهای ریزماهواره­ای طراحی شده بر اساس ترادف DNA ژنومی خرچنگ گرد   Longpotamon yangtsekienseبرای بررسی­ های تنوع درون­گونه ­ای استفاده گردید. بمنظور انجام آنالیز نهایی محصولات PCR مربوط به هریک از جایگاه­ های ریزماهواره، این محصولات بر روی ژل اکریل آمید 8% شارژ شدند. سنجش وزن مولکولی نوارهای محصول PCR و اندازه آلل­ ها با استفاده از نرم افزار Lab Image v.3.3.3 و با بکارگیری تصویر­های گرفته شده از ژل پلی اکریل آمید رنگ آمیزی شده انجام شد. فراوانی آللی، هتروزیگوسیتی مورد انتظار و مشاهده شده، تعداد آلل‌های واقعی و موثر در جایگاه‌های ریزماهواره‌ای، تنوع ژنتیکی و آزمون AMOVA در سطح احتمال 0.01 در نرم افزارهای Gene Alex، محاسبه گردید. درخت تبارشناختی با استفاده از نرم افزارMEGA v. 5.5 ترسیم گردید.
نتایج و بحث:
نتایج توالی یابی ژن COI نشان داد نمونه خرچنگ­های مورد مطالعه مربوط به گونه P.elbursi می ­باشد که با نتایج شناسایی ریخت­ شناسی منطبق بود. در این مطالعه در مجموع از 5 جفت نشانگر ریزماهواره­ای استفاده شد که جایگاه Ga2 با وجود بهینه ­سازی تکثیر نشد و دیگر جایگاه­ ها چند شکلی نشان دادند.  جایگاه hxx2 و Ga1 با 7 آلل و جایگاه Gagt4 با 3 آلل بترتیب دارای بیشترین و کمترین تعداد آلل در بین تمام جایگاه ­های هتروزیگوت بودند. نتایج نشان داد که جمعیت ­های این گونه خرچنگ دارای تنوع درون جمعیتی اندکی می ­باشد. دامنه هتروزیگوسیتی مشاهده شده (Ho) در میان ایستگاه­ های نمونه برداری در جایگاه ­های چهارگانه 0.51-0.100 و دامنه هتروزیگوسیتی مورد انتظار (He) بین 0.810- 0.515 بود. در این بررسی در تمامی مناطق نمونه ­برداری شده و در تمامی لوکوس ­ها، هتروزیگوسیتی مشاهده شده نسبت به هتروزیگوسیتی قابل انتظار پایین ­تر بود.
 نتیجه ­گیری:
شناسایی بر اساس نشانگرهای ژنتیکی برای قرار دادن صحیح گونه ­ها در جایگاه اصلی خود مفید بوده و م ی­تواند تایید کننده شناسایی­ های مبتنی بر ریخت شنایی باشد. کاهش هتروزیگوسیتی مشاهده شده نسبت به هتروزیگوسیتی مورد انتظار نشان دهنده کاهش در تغییرپذیری ژنتیکی نمونه ­ها است.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Assessment of genetic diversity of Potamon elbursi in eastern rivers of Tehran province

نویسندگان [English]

  • Siamak Yousefi Siahkalroodi 1
  • Samaneh Fadaie 1
  • Farideh Chenari 2
  • Shadi Khatami 3

1 Department of Biology, Faculty of Biological Sciences, Varamin-Pishva Branch, Islamic Azad University of Varamin, Varamin, Iran

2 Research and Development of mahiran, Protein Gostar Sina Co, Tehran, Iran

3 Department of Marine Biology, Faculty of Natural Resources, Bandar Abbas Branch, Islamic Azad University of Bandar Abbas, Bandar Abbas, Iran

چکیده [English]

Introduction:
investigation in genetical diversity are an effective tools for conservation of valuable, rare and endangered species. up until now, few studies have been conducted on the ecology of freshwater crabs in Iran and so their conservation issues are not fully known. This study aimed to assess the genetic diversity of the true crab, Potamon elbursi, from the eastern lakes of Tehran.
Material and methods:
The genetic structure of P. elbursi crab was investigated from the eastern rivers of Tehran Province using microsatellite markers. In order to study the genetic diversity within populations, 10 samples were caught with hand-operated net in different parts of Jajroud, Hablehrood and Lar rivers. Samples were first assessed for morphological variations using appropriate keys.  Molecular identification of species was performed by COI gene sequencing. Then, the characterization of microsatellite loci (i.e., hxx3, Gagt4, Ga1, Ga2, and hxx2) was done using primers from Longpotamon yangtsekiense. Allelic abundance, expected/ observed heterozygosity, true alleles abundance, and genetic diversity were assessed using AMOVA at p= 0.01 level. Using images of the stained polyacrylamide gel, the molecular weight of the PCR product bands and the size of alleles were measured using Lab Image v.3.3.3 software. The allele frequency, expected and observed heterozygosity, number of actual and effective alleles in microsatellite loci, genetic diversity, and AMOVA test were calculated at 0.01 probability level in Gene Alex software. The MEGA software v.5.5 was used for plotting the phylogenetic tree.
Results and discussion:
The results showed that the COI sequences of all specimens were identical with those of  P. elbursi, which was also confirmed by morphological analysis. The hxx2 and Ga1 positions with 7 alleles and Gagt4 with 3 alleles had the highest and lowest allele number among all heterozygote sites, respectively. The results also showed that the populations of this crayfish had a small intrinsic diversity.The observed and expected heterozygosity among the sampling stations at tetrad loci ranged from 0.100 to 0.51 and 0/81. 0.515-0.810, respectively.
Conclusion:
Molecular identification methods may be useful for finding the exact lineage of the species and confirming morphological identification methods. In this study, in all samples from all locations and all loci, the observed heterozygosity was lower than the expected heterozygosity.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Genetic diversity
  • Potamon elbursi
  • Fresh water
  • Tehran province

Alarco ́na, J.A., Magoulasb, A., Georgakopoulosb, T., Zourosb, C., Alvarez, M.C., 2004. Genetic comparison of wild and cultivated European populations of the gilthead sea bream (Sparus aurata), Aquaculture. 230, 65–80.

Alcock, A., 1909. Diagnoses of new species and varieties of freshwater crabs. No. 4. Records of the Indian Museum. 3, 375–381.

Bahmani, M. 1994. identification and distribution study of crabs in Hormozgan province, MSc thesis, Tehran Shomal unit, Islamic Azad University.

Bataillon,T.M.. David, J.L., Schoen, D.J., 1996. Neutral Genetic Markers and Conservation Genetics: Simulated Germplasm Collections. Genetics. 14, 409-417.

Brandis, D., storch, V., Türkay, M., 2000. Taxonomy and zoogeography of the freshwater crabs of europe, North Africa, and the Middle east. Senckenbergiana Biologica. 80, 5-56.

Carver T, Harris SR, Berriman M, Parkhill J, McQuillan JA, 2012. Artemis: an integrated platform for visualization and analysis of high-throughput sequence-based experimental data. Bioinformatics. 28, 464-469.

Christian P. Ridley, Ho Young Lee, and Chaitan Khosla. 2008. Evolution of polyketide synthases in bacteria. creavatity and collaboration. 105, 4595-4600.

Costa, F.O., Carvalho, G.R., 2007. The Barcode of Life Initiative: synopsis and prospective societal impacts of DNA barcoding of Fish. Genomics, society, and policy. 3, 29-40

Cumberlidge, N., Ng, P.K.L., Yeo, D.C.J., Magalhaes, C., Campos, M.R., Alvarez, F., Naruse, T., Daniels, S.R., Esser, L.J., Attipoe, F.Y.K., Clotilde-Ba, F.L., Darwall, W., McIvor, A., Baillie, JE..M., Collen, B., Ram, M., 2009. Freshwater crabs and the biodiversity crisis: importance, threats, status, and conservation challenges. Biology Conservation. 142, 1665-1673.

Duda, T.F. 2008. Differentiation of venoms of predatory marine gastropods: Divergence of orthologous toxin genes of closely related Conus species with different dietary specializations.Journal of Molecular Evolution,67:315-321.

Franklin J, B., Fernando, S.A., Chalke, B.A. and Krishnan, K.S. 2007. Radular morphology of Conus (Gastropoda: Caenogastropoda: Conidae) from India. Molluscan Research, 27:111–122.

Heldstab, H., Katoh, M., 1995. Low genetic variation in perch (Perca fluviatilis L.) from three major European drainage systems in Switzerland. Aquatic Sciences. 57, 14–19.

Jesse, r., Pfenninger, M., Fratini, s., scalici, M., streit, B., schubart, C.D., 2009. Disjunct distribution of the Mediterranean freshwater crab Potamon fluviatile - natural expansion or human introduction? Biology invasions. 10, 2209-2221.

Kalinowski, S.T., 2005. Do polymorphic loci require large sample sizes to estimate genetic distances. Journal of Heredity. 94, 33-36.

KeiKhosrAvi, A., Fratini, S., Schubart, C.D., 2015. Population genetic structure and demographic history of the freshwater crab Potamon elbursi (Brachyura: Potamidae) from the Alborz Mountains in northern Iran. Journal of Limnology. 74, 512-518.

Khatami, Sh, 1999. species identification and biological study of a freshwater crab from Jajrood River. MSc thesis, Tehran Shomal unit, Islamic Azad University. pp145.

Litt, M., Luty, J.A., 1989. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. American Journal of Human Genetics. 44, 397–401.

Lorenz, F. and Puillandre, N. 2015. Conus hughmorrisoni, a new species of cone snail from New Ireland, Papua New Guinea (Gastropoda: Conidae). EuropeanJournal of Taxonomy, 129: 1–15.

Monaghan, M.T., Balke, M., Gregory, T.R.and Vogler, A.P., 2005. DNA-based species delineation in tropical beetles using mitochondrial and nuclear markers. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences, 360, 1925–1933.

Nei, M., Maruyama, T., Chakraborty, R.,1975. The bottleneck effect and genetic variability in populations. Evolution. 29, 1-10.

Ng, P.K.L., Guinot, D. and Davie, P.J.F., 2008. Systema Brachyurorum: Part I. An annotated checklist of extant brachyuran crabs of the world. Raffles Bulletin of Zoology, Supplement. 17, 1–286.

Norris, A.T., Bradley, D.G., Cunningham, E.P., 1999. Microsatellite genetic variation between and within/farmed and wild Atlantic salmonSalmo salarpopulations. Aquaculture. 180, 247–264.

Pujolr, J.M., Capoccioni, F., Ciccotti, E., Deleo, G.A., Zane, L. 2009. Genetic variability is unrelated to growth and parasite infestation in natural populations of the European eel (Anguilla anguilla). Molecular Ecology. 18, 4604-4616.

Peakall, R., Smouse, P.E., 2008. A heterogeneity test for fine-scale genetic structure. Central European Journal of Biology.17, 3389-3400.

Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A. and Kumar, S. 2013. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0.

Zheng, X., Ikeda, M., Kong, L., Lin, Q.L., Taniguchi, N., 2009. Genetic diversity and population structure of the golden cuttlefish, Sepia esculenta (Cephalopoda: Sepiidae) indicated by microsatellite DNA variations. Marine ecology. 4, 448-454.